8. Inoculation du milieu de culture

Il faut maintenant introduire notre inoculum (constitué de spores libres, de spores/mycélium en solution ou morceau de agar envahit de mycélium), ce dernier étant libre de compétiteur, dans notre milieu de culture. Cette opération doit encore et toujours ce faire en milieu stérile de façon à ne pas introduire de compétiteurs dans le milieu de culture. De plus si vous allez procéder à l'inoculation à partir d'une solution que vous comptez réutiliser plusieurs fois il faut évidemment éviter de la souiller. C'est pour cela qu'un petit coup d'oeil à la partie parlant de l'hygiène ne vous fera pas de mal.

• Inoculation de spores libres
• Inoculation de spores/mycélium en solution
• Inoculation par un morceau de agar
• Entretien
• Les sclerotia

Inoculation de spores libres

Pour rappel cette technique est un peu dépassée et constitue un peu un gaspis de spores. De plus elle ne convient pas au milieu de type boulette.

En fait les manipulations sont identiques à celle de la préparation de spores en solution, à part que le bocal contient du seigle et non de l'eau ...

• Respectez les procédures d'hygiène et mettre dans la boîte à inoculation :
• 2-3 bocaux de seigles stérilisés.
• L'empreinte de spores.
• Le scalpel propre que vous aurez préalablement passé à la flamme et que vous laissez refroidir dans la boîte, en veillant que la lame ne touche rien.
• Phase stérile depuis maintenant : ouvrez le sachet de l'empreinte de spore mais ne la sortez pas.
• Dévissez les couvercles entièrement, tout en les laissant sur l'ouverture.
• Mettre dans la boîte : le scalpel, l'empreinte contenue dans son sachet fermé et préparer le réchaud à alcool (laissez-le en dehors de la boîte.
• Il faut maintenant introduire des spores dans le bocal en ouvrant son couvercle aussi brièvement que possible :
• Dévisser entièrement le couvercle du bocal et laissez-le en position, posé sur l'ouverture.
• Passez le scalpel à la flamme. Laissez-le bien refroidir (durant 1 mn au moins)
• Ouvrir le sachet. Y introduire le scalpel (qui est à peine tiède!) sans sortir l'empreinte. En gardant l'empreinte horizontale, grattez un peu les spores de façon à en déposer sur la lame du scalpel.
• Entrouvrez le couvercle du bocal d'une main, glissez le scalpel au dessus de l'ouverture du bocal et tapez plusieurs fois le scalpel sur le rebord du bocal de façon à faire tomber les spores dedans. Refermez rapidement le bocal et serrez le couvercle.
  Attention: Vous ne verrez presque pas de spores tomber car ceux-ci sont microscopiques. C'est pour cela que vous aurez peut-être l'impression de n'avoir rien mis dedans mais sachez que le moindre grain noir que vous pourrez apercevoir contient de dizaines de milliers de spores !
• Remettre et serrer le couvercle.
• Remuez un peu le bocal de façon à recouvrir la surface supérieure du seigle, ou vous avez fait tomber les spores, par du seigle humide vierge. De cette façon les spores ne se dessécheront pas.
• Procédez de même pour tous les bocaux. Lorsque ceux qui se trouvent dans la boîte ont été inoculés, sortez-les par la trappe et faites entrez les nouveau de la même façon.
• Stockez le tout dans un endroit propre à 25 deg. C.

Inoculation de spores/mycélium en solution

• Stérilisez la seringue (si ce n'est pas une jetable préstérilisée) :
• Nettoyez-la bien à l'eau claire
• Mettez l'aiguille. Mettre le tout, l'aiguille en bas, dans un bocal de 2.5-5 dl en recouvrant l'ouverture de papier d'allu.
• Stérilisez le tout à la marmite à vapeur durant 30mn.
• Laissez refroidir jusqu'à une température tiède
• Mettre les bocaux de milieu de culture (2 ou 3), le bocal de solution et le bocal contenant la seringue stérile (avec le papier d'allu) dans la boîte à inoculation. Préparez le réchaud à alcool.
• Phase stérile maintenant.
• Aspirez de la solution dans la seringue :
• Dévissez le couvercle du bocal de solution et des bocaux de seigle (dans le cas du milieu de type boulette, laissez le couvercle vissé).
• Imprimez un léger mouvement circulaire au bocal de solution de manière à mettre les spores ou le mycélium en suspension.
• Passez l'aiguille de la seringue à la flamme.
• Entrouvrir le couvercle d'une main et aspirez quelques millilitres de solution de l'autre. Remettre le couvercle aussitôt après.
• Introduire la solution dans le bocal :



Inoculation de bocaux : à gauche un bocal contenant le milieu classique, à droite le milieu de type boulette.

Dans le cas du milieu classique	Dans le cas du milieu boulette
Entrouvrez le couvercle et laissez tomber 2-3 ml de la solution sur le seigle. Essayez de répartir au mieux. Refermez tout de suite le couvercle et serrez-le. (Image de gauche ci-dessus)	Enlevez le papier d'allu qui protégeait les trous du couvercle et introduisez la seringue suffisamment pour que la solution soit déposée en dessous de la couche protectrice. Mettre 2-3 ml. pour chaque bocal. (Image de droite ci-dessus) Ajoutez ensuite un morceau de bande adhésive sur chaque trou.

• Répétez le processus pour chaque bocal et n'oubliez pas de passer la pointe de la seringue à la flamme entre chaque bocal.

Inoculation par un morceau de agar

Cette méthode n'est valable que pour le milieu de culture classique !.

Nous allons introduire un morceau de agar que nous aurons découpé au scalpel dans une boîte de Pétri.

• Respectez les procédures d'hygiène et mettre dans la boîte à inoculation :
  
• 2-3 bocaux de seigles stérilisés.
• Une boîte de Pétri colonisée par une bonne souche.
• Le scalpel propre.
• Dessérez les couvercles de bocaux.
• Passez le scalpel à la flamme.
• Découpez quelques bout de agar dans la boîte, par exemple des carrés de 1cm de côté
• Soulevez brièvement le couvercle du bocal de seigle et introduisez-y un morceau de agar.
• Serrez le couvercle.
• Entrez chaque nouveau bocal, passez le scalpel à la flamme.

Entretien

Il faut stocker les récipients inoculés dans un endroit propre et sombre où la température est la plus proche possible de 25 deg. C.

D'ici quelques jours (7 au maximum) vous devriez constatez l'apparition de zone blanche à l'intérieur de votre récipient (si ce dernier est transparent). Consultez le chapitre sur les infections pour être sur que vous avez à faire à du mycélium et uniquement du mycélium.

Pour le milieu de culture classique :

Une fois que le mycélium à envahit environ 10 % du seigle, secouez énergiquement le bocal (après avoir fermement vissé le couvercle), de manière à répartir le zone de mycélium dans le bocal et accélérer la colonisation. Dessérez légèrement le couvercle (de manière à laisser le mycélium respirer) et remettez les bocaux à leur place, à 25 deg. C.
Avant de faire ceci vérifiez bien que le bocal n'a pas de fissure, car si vous le tapez contre la paume de la main (ceci n'est pas très recommandé) et qu'il se brise à cet instant vous pouvez vous blesser très sérieusement. Pour éviter tout risque, utilisez des gangs pour tenir vos bocaux et tappez-les contre un vieux ou tout autre pièce massive de caoutchouc.

Pour le milieu de type boulettes :

Après environ 7 jours vous pouvez enlevez les bandes adhésives qui bouchent les trous.Il faut noter que la colonisation est plus lente pour le milieu de type boulettes, bien que ceci dépende de la quantité et répartition de la solution inoculée.

Progressivement, le mycélium va envahir la totalité du seigle contenu dans le bocal. Assurez vous tout de même qu'il ne contienne aucune infections et seulement du mycélium sains. Si cela est le cas, vous pourrez passer à la suite des opération, à savoir :

• Le mettre en condition de fruitaison
• L'utiliser pour inoculer un milieu de fruitaison (seulement dans le cas du seigle)

Les sclerotia

Certaines espèces comme le psilocybe mexicana et le psilocybe tampaenensis ont l'intéressante propriété de former des sclerotia dans le milieu de culture après quelques mois passés dans la pénombre et à la température idéale.

Ces petites concrétions de mycélium forment de petits "space"-bonbons appelés Camote ou cosmic camote et sont une voies à suivre pour le mycologiste ayant réussi à passer le premier stade (parfois douloureux?) de la maîtrise du psilocybe cubensis.

Dans un registre moins psychédélique, le truffes contenues dans certains foies gras en sont un autre exemples.

Les manipulations

Classiques, sauf que le milieu de culture est laissé volontairement sur-incubé durant 2-4 mois.

• Préparation de la souche sur agar. (je ne sais pas si une inoculation de solution de spores fonctionnerait aussi bien que pour le psilocybe cubensis)
• Préparation du milieu de culture : L'ivraie est apparemment idéale mais libre à vous de faire des expériences en essayant d'autres type de grains. Le milieu de culture de type boulettes ne va sans doute pas aller.
• Inoculation du grain et incubation dans la pénombre à 23-24 deg. C. durant 2 à 4 mois, en laissant le couvercle du bocal légèrement dessérez.

La récolte

Après la durée de sur-incubation, les bocaux sont ouverts et les grains émiettés soigneusement de façon à en retirer les camotes.