6. Préparation de l'inoculum
Le terme innoculum désigne les spores/mycélium en solution ou
non que l'on va introduire dans le milieu de culture. Il devra être
vierge de tout compétiteur.
Vous avez donc le choix entre inoculer:
- Des spores libres : pas recommandé.
- Des spores en solution : idéal si votre empreinte de spore est
propre. Cette solution est la plus facile.
- Un bout de agar envahit par le mycélium :
Solution un peu
désuète car elle ne permet pas d'inoculer une quantité
industrielle de bocaux contenant le milieu de culture et ne possède
pas les avantages de l'inoculation en solution.
- Du mycélium en solution : on a la maîtrise de la souche, ceci peut être
nécessaire pour certaines espèces ... mais pas pour le
psilocybe cubensis, qui se cultive très facilement en
multispores.
Pour que ce documents soit bien complet, chacun des points ci-dessus sont
détaillés :
Préparation pour les spores libres
Vous avez choisi cette voie désuète, soit. Il n'y a aucune
préparation spéciale.
Prenez seulement soins de ne pas ouvrir le plastique contenant l'empreinte.
Il ne faudra l'ouvrir qu'au moment de l'inoculation et dans la
boîte à inoculation.
Préparez tout de suite le milieu de culture
Préparation des spores en solution
Nous allons mettre des spores en solution dans de l'eau distillée
contenue dans un petit bocal.
- Nous allons utilisez la boîte à inoculation:
lisez attentivement et appliquez les recommandations contenue dans la
partie hygiène.
- Remplissez à moitié un bocal de 2.5 dl avec de l'eau
distillée. Stérilisez-le durant 30 mn dans la marmite à
vapeur.(référez-vous aux procédures de stérilisation)
- Laissez-le refroidir ! Mettez-le en attendant dans la
boîte à inoculation que vous venez de nettoyer parfaitement.
A partir de maintenant les manipulations se font dans la boîte.
- Mettre dans la boîte : le scalpel, l'empreinte contenue dans son
sachet fermé et préparer le réchaud à alcool
(laissez-le en dehors de la boîte.
- Il faut maintenant introduire des spores dans le bocal en ouvrant son
couvercle aussi brièvement que possible :
- Dévisser entièrement le couvercle du bocal et
laissez-le en position, posé sur l'ouverture.
- Passez le scalpel à la flamme. Laissez-le bien refroidir (durant
1 mn au moins)
- Ouvrir le sachet. Y introduire le scalpel (qui est à peine
tiède!) sans sortir l'empreinte. En gardant l'empreinte horizontale,
grattez un peu les spores de façon à en déposer sur la
lame du scalpel.
- Entrouvrez le couvercle du bocal d'une main, glissez le scalpel au
dessus de l'ouverture du bocal et tapez plusieurs fois le scalpel sur le
rebord du bocal de façon à faire tomber les spores dedans.
Refermez rapidement le bocal et serrez le couvercle.
Attention: Vous ne verrez presque pas de spores tomber car ceux-ci sont
microscopiques. C'est pour cela que vous aurez peut-être l'impression
de n'avoir rien mis dedans mais sachez que le moindre grain noir que vous
pourrez apercevoir contient de dizaines de milliers de spores !
- Imprimez un léger mouvement de rotation au bocal de façon
à mélanger les spores.
- Laissez incuber cette solution (à 20-25 deg. C.) durant 2-3
jours. Durant ce temps vous pouvez préparez le milieu de culture.
N'oubliez pas que cette technique nécessite la préparation du
agar, que vous pouvez préparez durant
l'incubation.
Préparation de l'inoculum sur agar
Il faut tout d'abord préparer du agar.
La marche à suivre est essentiellement la même que la
préparation de la solution de spores sauf qu'on
utilise la boucle à inoculation (à la place du scalpel) pour
déposer des spores à la surface du agar :
- Mettez les boîtes de Pétri, l'empreinte et la boucle dans
la boîte à inoculation et préparez le réchaud.
- Passez la boucle à la flamme et refroidissez-la en la trempant
plusieurs fois dans le agar de la boîte de Pétri que vous allez
inoculez (entrouvez un peu le couvercle d'une main).
- Ouvrez le sachet, introduisez-y la boucle (froide!) : en grattant un peu
la surface du papier où se trouve l'empreinte les spores vont coller
au agar se trouvant sur la boucle.
- Entrouvrir la boîte de Pétri et tapotez à plusieurs
endroits avec la boucle à inoculation.
- Refermez le couvercle et mettez un élastique pour le tenir en
place.
Laissez incuber les boîtes dans un endroit propre et à l'abris de la lumière, à 25 deg. C. Evitez les changements brusque de température. D'ici 2 à 7 jours des signes de pousse vont apparaître. Cela aura l'apparence d'un léger duvet de coton.
Si vos spores sont vieux, il se peut très bien que rien ne pousse du tout. Le temps les a déssechés ... il faut les humidifier en les mettants en solution, puis en l'inoculant sur la boîte de Pétri. Ceci est décrit dans inoculation du milieu de culture/test de la solution sur agar. A titre anecdotique, les premiers spores que j'ai eu ont du tremper durant 10 jours avant de présenter des signes de germination !! Evitez tout de même de le tremper trop longtemps, ceci favorisant également le développement des contaminants.
Il faut maintenant isoler une bonne souche avant de
l'inoculer dans le milieu de culture.
Préparation d'une solution de mycélium
Cette technique est la plus "professionnelle" mais elle présente
quelques difficultés techniques lors de l'inoculation (ces problèmes seront détaillés dans la partie concernant l'inoculation du milieu de culture). Elle ne sera pas abordée avec
un maximum de détail...
Il faut tout d'abord obtenir un bout de agar contenant une bonne souche. Pour
cela reportez-vous à la prération de
l'inoculum sur agar puis isoler une bonne
souche.
- Stérilisez un bocal de 2.5-5 dl remplit à moitié
d'eau distillée contenant 1 croquettes pour chat broyée.
- Découpez 2-3 morceaux de 1cm carré dans le agar du boîte de
Pétri contenant une bonne souche. Mettre ces carrés dans le
bocal. Vissez fermement le couvercle.
- Laissez incuber durant 1 semaines et secouez énergiquement
tout les deux jours.